ChIP-Seq

ChIP 은 Chromatin Immunoprecipitation의 약자로 세포내에서 이뤄지는 단백질과 DNA간의 상호작용을 알아내는 주요한 방법으로 특정 단백질과 binding 하는 DNA sequence 를 알아내는 것을 목적으로 합니다. 특정 단백질과 결합된 DNA을 면역학적 방법인 antibody를 이용하여 침강시킨후 결합된 DNA를 따로 분리하여 그 sequence를 확인합니다. 이때, 해당 서열을 확인 하는 방법으로 microarray방식을 이용하면, ChIP-chip이 되고, NGS와같은 시퀀싱 방식을 이용하면 ChIP-seq이 됩니다. 이러한 방법은 유전자 발현을 조절하는 전사조절인자(transcription factor)의 bindig site와 기작을연구하는데 많이 이용되고 있습니다.

예를 들어 transcription factor A의 binding-site를 분석하기 위해, 먼저 세포내에서 transcription factor A와 DNA를 결합시킨 후 그 결합을 고정하기 위해 sample을 포름알데히드와 같은 고정액으로 고정시킵니다. 이후 세포를 lysis하여 DNA 전체를 분리한 다음 sonication 방법으로 DNA를 잘게 조각냅니다. 그러면 transcription factor와 결합된 상태의 DNA 조각과 그렇지 않은 조각이 생성됩니다. 이후 원하던 transcription factor A에 binding된 DNA 조각만을 분리하기 위해 transcrition factor A 특이적인 antibody와 beads 붙여 원심분리를 통해 transcription factor A와 이에 결합된 DNA만을 분리해 낼 수 있습니다. 마지막으로 분리된 transcription factorA와 DNA 사이의 결합을 끊어 DNA만을 분리해낸 다음 앞서 언급한 microarray방식과 NGS 기술을 이용한 시퀀싱 방식을 통해 각각 확인할수 있습니다. Microarray방식은 유전체상의 대부분의 영역을 microarray probe로 제작하여 chip에 심은 후 transcription factor A와 결합되었던 DNA조각을 binding 시켜 확인하게 되며, 시퀀싱 방식은 분리된 DNA조각을 직접적으로 시퀀싱을 통해 확인하게 됩니다. 이후 시퀀싱된 서열을 해당 유전체 서열에 mapping(reference assembly)을 통해 유전체 상의 binding location을 확인 합니다. 이들 모두 공통적으로 transcription factor A가 binding 하는 서열정보를 비롯하여 유전체내의 binding location을 함께 확인 할 수 있어 이차적으로 전자를 조절 받는 유전자 프로파일을 함께 확인 할수 있는 이점이 있습니다.

단백질과 binding 되는 DNA 서열이 짧기 때문에 , ChIP-Seq 분석을 할 때는 일반적으로 short read로 시퀀싱을 진행합니다. 또한 reference 서열에 mapping 할 때 역시 mapping 파라메터들을 엄격하게 설정하여 noise data의 생성을 예방합니다. 시퀀싱 reads의 서열들이 짧기 때문에 적은 bp의 mismatch나 gap일 지라도 실제 binding site가 아닌 엉뚱한 위치에 mapping될 확률이 높아 지므로 최종적으로 ChIP peak를 찾기 힘들어지게 될 수 있습니다. Mapping view를 보면 이렇게 특정 단백질에 특이적인 binding-site에만 read들이 mapping 되어 형성되는 'peak'을 확인 하실수 있습니다(Candidated transciption factor A binding position).

Peak 영역에 mapping된 read의 수와 전체 reference 서열의 mapping 된 read의 분포, 그리고 control 데이터에 mapping된 read의 분포 등을 고려하여 관찰되는 peak가 false positive인지 false negative인지 통계적으로 유의성을 검증할 수 있습니다. CLC Genomics Workbench를 이용하면 이렇게 찾아진 ChIP peak들에 대한 정보가 담긴 테이블과 해당 ChIP peak가 위치한 부분의 mapping view를 한 화면에서 확인할 수 있습니다.

그리고 mapping view를 조금 더 축소해 보면 해당 peak의 upstream과 downstream에 위치한 유전자를 확인하여, 어떤 유전자들이 해당 transcription factor A에 영향을 받을지 유추해 볼 수 있습니다.

부가적으로 BIOBASE사의 'TRANSFAC' 데이터베이스는 발표된 모든 논문들을 대상으로 생물 전문 큐레이터들이 검토하여 transcription factor와 transcription factor binding site에 대한 정보를 축적하고 있습니다. 또한 이렇게 형성된 TRANSFAC의 데이터는 보다 효율적으로 연구자들에게 공급하기위해 CLC Genomics Workbench에서 plug-in을 통해 ChIP-seq을 통해 찾아진 peak와 직접적으로 비교하여 관련된 유전자, 질병 및 mutation에 대한 다양한 정보를 제공 하고 있습니다.

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 Biobase의 대표적인 제품군인 TRANSFAC은 eukaryotic gene regulation을 분석하기 위한 최적의 기초 데이터를 제공하고 있다. Transcription factors, miRNAs, 그리고 이들과 관련된 유전자의 프로모터 정보를 비롯하여 ChIP-Seq 데이터로부터 1,000,000건 이상의 binding sites 정보, 57,000건 이상의 human RNA polymeraseII의 위치정보를 포함하고  있다. 이들 정보는 모두 실험적으로 증명 되었거나 논문에 게재된 정보를 전문가의 리뷰를 통해 정확하면서도 통합적인 이해를 할 수 있도록 하였다.

 2010년 현재 TRANSFAC®의 데이터베이스는 DNA binding, expression 그리고 regulation에 관련한 전문가의 manual curation을 다음과 같이 수행하였다.


이들 데이터는 실험적으로

• transcription factor binding site나 혹은 composite elements를 증명하고자       할 때,
• promoter sequence를 찾고자 할 때
• miRNA targets을 찾고자 할 때
• 관심 있는 영역에 binding 가능한 transcription factor를  찾고자 할 때
• transcription factor들 간의 조절을 알고자 할 때
  

 실험에 앞서 가능한 factor들의 기초 정보를 제공하게 된다. 따라서 microarray를 통한 유전자 발현 패턴을 분석했다면 동일한 발현 패턴을 보이는 유전자들의 상관관계를 분석하는데 많이 이용되며, 약리 반응이나 신물질의 target을 밝히는 데에도 기초 자료로 인용되고 있다.

TRANSFAC®의 데이터 구성

 TRANSFAC® Professional은 공개된 데이터에 비해 약 4년 정도의 데이터가 업데이트되어 있는 상태로 그 데이터양은 promoter서열이 약 280,000건, 700,000건의 ChIP-chip/-Seq 데이터를 더 포함하고 있다(figure 1).

미지의 서열에 binding 가능한 transcription factor search.

 특정한 발현 패턴을 보이는 유전자의 발현 조절 메커니즘을 분석 하고자 할 때 기본적으로 유전자의 upstream 영역에서 작용하는 transcription factor(TF)를 알아보게 된다. TRNASFAC®은 기본적인 transcription factor 및 binding site에 대한 정보를 제공함과 동시에 미지 서열에 binding 가능한 transcription factor를 예측할 수 있는 MatchTM, PatchTM, 그리고 Catch® 프로그램도 제공하고 있다(Figure 4).

Figure 4. TRANSFAC Professional의 TF search를 위한 PATCH. Pattern match를 통한 미지의 서열에 binding 가능한 TF를 search한다. 이때 false positive를 최소화하기 위해 찾고자 하는 TF의 종 정보를 제한하여 식물 유전자의 경우 식물 데이터베이스를 사용하고 mamalian 유전자의 경우 mamalian 데이터베이스를 사용한다. 또한 특정 찾고자 하는 TF만을 대상으로 할 경우 분석자에 의해 선택된 TF만으로 구성된 프로파일을 제작하여 분석할 수도 있다.


 MatchTM는 TF의 binding site를 matrix로 구성하여 찾는 방법이며, PatchTM는 서열의 pattern match 방법을 이용하여 찾는 방법이다. Catch®는 composite elements를 찾고자 할 때 사용하게 되는데 보통 이들 프로그램을 모두 사용하여 가능한 모든 TF를 찾고 실험에 이용한다. 또한 실험적으로 하나하나 규명할 수도 있으나 유전체 전체 유전자를 대상으로 분석하고자 할 때, 웹으로 운영되는 다음 프로그램에 서열을 하나씩 분석하기는 매우 어려우므로 local 서버나 PC에 설치하여 batch로 서열을 분석할 수도 있다. 이후 얻어진 유전자의 upstream 영역에서 작용하는 TF의 profile정보는 통계적 기법을 통해 유의한 TF를 선별하기도 하고, 데이터베이스화하기도 한다.

또한 얼마 전 덴마크의 CLCBio사와의 협력을 통해 CLCMainWorkbench 혹은 CLCGenomicsWorkbench의 plug-in 기능을 통해 TF정보를 visualization 할 수도  있게 되었다. 따라서 NGS에 의한 RNA-seq 정보 및 유전자 발현정보와 함께 전사조절 ,    메커니즘까지 확대하여 함께 분석할 수 있는 최적의 데이터를 제공하고 있는 것이다.

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   1. Assembly
   2. Variation study
   3. Expression study
   4. Epigenomics
  5. Genome Annotation
   6. Next Generation Bioinformatics
   7. Data Management for web 2.0 Era
   8. Semantic Network for Integrated Biology Data
   9. Gene Network Discovery by Text-mining
  10. Centralization for High-throughput Data Analysis

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연재 순서

   1. Assembly
   2. Variation study
   3. Expression study
   4. Epigenomics
   5. Genome Annotation
   6. Next Generation Bioinformatics
   7. Data Management for web 2.0 Era
   8. Semantic Network for Integrated Biology Data
   9. Gene Network Discovery by Text-mining
  10. Centralization for High-throughput Data Analysis

이번 연재에서는 Next Generation Sequencing의 두 번째 Application인 Expression study 중에 유전자와 엑손의 발현 및 발현된 유전자의 각종 변이 등을 한 번에 연구할 수 있는 RNA-Seq 분석에 대해 알아보겠습니다.

2-2-6. RNA-Seq Analysis

 Serial Analysis of gene Expression(SAGE), Cap Analysis of gene expression (CAGE), 그리고 Massively Parallel Signature sequencing(MPSS)은 특정 유전자의 발현 양 정보를 얻고자 하는 목표로 수행되는 방법들이다. 이러한 방법들은 많이 이용되고 있지만 Sanger 방법에 바탕을 둔 것으로 높은 비용과 짧은 reads는 reference 서열에 유일하게 매핑하기 힘들다는 문제점을 가지고 있다. 이러한 문제점들을 극복하기 위한 방법으로는 유전자와 엑손의 발현 및 발현된 유전자의 각종 변이 등을 한 번에 연구할 수 있는 RNA-Seq기술이 있다[1].

표 1에서 보는 것과 같이 RNA-Seq을 분석 할 수 있는 프로그램에는 여러 가지 소프트웨어가 있는데 그 중에 CLC Genomics Workbench는 annotation된 Reference 유전체 서열과 mRNA 시퀀싱 reads를 바탕으로 새로운 엑손의 발굴뿐만 아니라 유전자 발현 레벨을 계산할 수 있다. RNA-Seq 분석은 몇 가지 단계로 수행된다. 먼저, Reference 서열에서 모든 유전자를 추출한다. 이 때 유전자 서열의 다른 annotation들은 보존된다[23].

다음으로 영역 주변의 엑손-엑손 경계를 추출한다. 그 다음으로 모든 엑손-엑손 junctions plus에 대한 Reference assembly가 수행된다. 이 assembly로부터 각각의 유전자에 대해 발현 수치가 계산되고 putative exon을 확인할 수 있다. 발현 수치는 RPKM(reads per kilobase of exon model per milion mapped reads)방법으로 측정된다(그림 9).

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